顽固派还不断地直接向维新派发起攻击，光绪帝曾大胆地给予反击。五月初二，帝党御史宋伯鲁、杨深秀因礼部尚书许应騤阻挠疏请废八股之议，奏劾许“守旧迂谬，阻挠新政”。光绪帝遂命许应騤明白回奏。许百般掩饰，借机攻击康有为“摇惑人心，混淆国是”，请将其“驱逐回籍”。遭到光绪帝申斥。五月二十日后党御史文悌严参康有为“遍结言官，把持国是”。光绪帝怒将文悌斥回原衙门行走。七月十九日，礼部尚书怀塔布、许应骙、侍郎堃岫、徐会沣、溥颋、曾广汉以阻挠主事王照上书言事，被光绪帝革职。次日，光绪帝又赏谭嗣同、杨锐、刘光第、林旭四人四品卿衔，在军机章京上行走，参预新政事宜。这几件大事极大地激怒了后党顽固派，新、旧两党矛盾迅速激化，后党大臣荣禄、刚毅、怀塔布等纷纷活动，加紧策动政变。
康有为等维新派早有以“尊君权”、“去太后”为目的的军事政变计划，看到后党顽固派加紧政变准备，亦多方努力促成军事政变计划之实施。他们拉拢袁世凯，企图借助其兵力诛杀荣禄，包围颐和园，劫持西太后，保护光绪帝，捍卫变法新政。光绪帝不知维新派计谋，但召见袁世凯，破格赏其侍郎头衔，以备缓急可恃；且孤注一掷，大量提拔维新人士，拟开懋勤殿以议制度；又定于八月初五召见日本前首相伊藤博文；维新派和帝党官员亦频频接触伊藤，上折请聘其为新政顾问官。这两件事更引起后党集团极大疑忌，他们最害怕帝党掌握武装，最担心维新派与外国势力结合，促使帝国主义扶植光绪帝从慈禧手中夺权。于是慈禧决定抢先在光绪接见伊藤之前发动政变。八月初三，后党御史杨崇伊向慈禧上密折，请太后“即日训政”。后党主将荣禄于同日调兵遣将，为发动政变预作军事部署。维新派亦加紧行动，谭嗣同于当日夜访袁世凯，策动袁执行“杀(荣)禄锢后”计划。袁佯作应允，但借词延缓执行。
初四，慈禧突然从颐和园回宫，发动政变，幽禁光绪。初五，光绪在慈禧严密监视下，处理了两件原先预定的政务，一是召见袁世凯“请训”，二是召见伊藤博文。初六，慈禧假光绪帝名义，发布吁请太后训政的诏书，宣布第三次临朝训政，下令逮捕康有为和康广仁。袁世凯于初五“请训”后回津，立即向荣禄告密，荣沉吟良久，得悉政变“已自内先发”的讯息后，始将袁告密内容密报慈禧。初九，慈禧下令逮捕谭嗣同、杨锐、刘光第、林旭、杨深秀。十三日此五人与康广仁一起被杀于北京菜市口，史称“戊戌六君子”。康有为、梁启超逃亡日本。支持变法维新的官员陈宝箴、江标、黄遵宪、张荫桓等数十人或被捕系狱，或罢官，或遣成边陲。除京师大学堂和通商、惠工、重农、育才等洋务项目外，废除全部新政，戊戌变法失败。
