从２０世纪初，巴甫洛夫又开始研究高级神经活动，第一次发现了大脑皮层机能的活动规律。
他又给一条狗动了手术，在狗的腮帮子上开个小孔，用一根细细的导管安在它的一个唾液腺上。当狗吃东西流唾液的时候，一部分唾液就通过导管流到了外面。
巴甫洛夫通过实验发现，只要食物落到狗的口中，它就会泌出唾液，如果食物是湿的，分泌的唾液就少些，食物是干的，分泌的就多些。这种反射活动是狗和其它一切动物生来就有的，巴甫洛夫称它为非条件反射。
但后来的实验中，他又发现一个非常重要的事实，除了食物刺激口腔会引起狗的唾液分泌以外，其他的刺激，比如光、声音等的刺激，也能引起狗的唾液分泌。
为了通俗、形象地说明这种现象，在一次实验时，巴甫洛夫举起一只柠檬，对观看实验的学者说：
“诸位都知道这是柠檬，我不准备把它送到你们口中，只是让大家看一看……”
说到这里，所有在场的人的口中都流出了口水，许多人不自觉地咽了一下，并且笑出声来。
巴甫洛夫接着说：“诸位并没有吃到柠檬，却流出了口水。但诸位又是吃过柠檬的，知道它很酸，所以一见到它就流出了口水。这种流口水的反射是有条件的。因此我们称它为条件反射。”
从“非条件反射”到“条件反射”，巴甫洛夫经历了漫长而又艰苦的实验过程，这是消化生理过程中的一项重要发现，为人类在生理学方面的研究，做出了巨大的贡献。为此，在１９０４年，诺贝尔奖基金会该年度的生理学和医学奖金，授予了巴甫洛夫教授。要知道，巴甫洛夫是世界生理学家中第一个享有这种荣誉的科学家。
